Details

Dit onderzoek richt zich op een nieuwe methode voor het conserveren van drinkwatermonsters voor moleculaire diagnostiek. Het vermoeden is dat het RNA/DNA in watermonsters na bemonstering niet voldoende geconserveerd is, wat kan leiden tot een lagere detectie van bacterieel RNA/DNA bij gebruik van bepaalde diagnostische methoden. Bij de huidige methodes worden watermonsters van de tap in steriele flessen met conserveringsmiddel genomen waarna deze flessen bij 5°C naar het laboratorium verstuurd en bewaard worden en over het algemeen binnen 24 uur na monstername worden verwerkt. De Dual Filter Capsule (DFC) methode van Sylphium biedt een alternatieve methode voor monstername. De DFC methode bestaat uit een filter capsule voor monstername, conservering na bemonstering, en een isolatie kit. De filtratie wordt tijdens de monstername uitgevoerd en het RNA/DNA wordt direct geconserveerd in de capsule. Ook kunnen deze filter capsule bij kamertemperatuur worden bewaard en vervoerd. De DFC methode heeft potentie, maar is nog niet toegepast voor bacteriologische RT-(q)PCR, qPCR of next generation sequencing (NGS) onderzoek in drinkwater gerelateerde matrices. In dit project is een vergelijkingsonderzoek uitgevoerd in het laboratorium of de DFC methode een geschiktere methode is voor RNA/DNA onderzoek in drinkwatermonsters dan de huidige detectie methodes (flessenbemonstering, filtratie in het laboratorium, en DNA isolatie met kit). De DFC methode is getest voor detectie van Legionella pneumophila, waarbij de resultaten zijn vergeleken met de huidige detectie methode. De testen zijn uitgevoerd met kraanwatermonsters die zijn gemengd met oppervlaktewater en/of gecultiveerde cellen in verschillende concentraties. De DFC methode is effectief in het isoleren van DNA. Bij hoge concentraties L. pneumophila worden met de DFC methode ook hogere concentraties van de specifieke genen aangetoond dan met de huidige methode. Voor de lage concentraties zijn de resultaten van beide methodes vergelijkbaar. Voor conservering van RNA is de DFC methode getest voor detectie van E. coli en Enterococcen. Ook hier zijn verschillende testen uitgevoerd met kraanwatermonsters die zijn gemengd met oppervlaktewater, ijzer en mangaan houdend grondwater, en/of gecultiveerde cellen in verschillende concentraties. De isolatie van RNA met de DFC methode is nog niet optimaal. De Cq waarden van E. coli, Enterococcen en de interne controle zijn hoger (wat lagere aantallen gen kopieën betekent) en fluctueren minder per watermonster dan wordt waargenomen bij de huidige detectie methode. De RNA isolatie werkt beter voor gramnegatieve bacteriën dan voor gram-positieve bacteriën. Er wordt verwacht dat optimalisatie voornamelijk zit in het gebruiken van het eiwit lysozym (naast de chemische lysis) voor betere degradatie van de celwanden. Het is opvallend dat voor de RNA isolatie minder remming lijkt op te treden met de DFC methode in oppervlaktewater- en grondwatermonster in vergelijking met de huidige methode, naar alle waarschijnlijkheid komt dit door de isolatie kit van de DFC methode. De DFC methode heeft potentie om gebruikt te worden voor betere conservering van monsters, op basis van dit onderzoek, op dit moment alleen voor DNA analyses. In volgend onderzoek wordt aanbevolen om de mogelijk verminderde remming tijdens PCR verder te valideren met complexe water matrixen en organismen (voor DNA onderzoek), en om tijdsafhankelijkheid van het bewaren van de filter capsule mee te nemen. Ook kan er worden onderzocht of het opwerken van het volledige monster bij de DFC methode resulteert in lagere detectiegrenzen (momenteel wordt slechts 40-57% van het monstermateriaal gebruikt). Dit kan mogelijk ook worden behaald door een andere DNA isolatie kit te gebruikendan de kit die wordt meegeleverd met de DFC methode. Verder kan worden onderzocht of het gebruik van het eiwit lysosym (naast de chemische lysis) in de RNA/DNA isolatie kit van Sylphium een beter celwanden kapot kan maken en zo hogere RNA concentraties genereerd. Tot slot, kan onderzocht worden of de filter capsule gebruikt kan worden in de voorkweek voor Vitens.

This research focuses on a new method for preserving drinking water samples for molecular diagnostics. It is suspected that the RNA/DNA in water samples is not sufficiently preserved after sampling, which may lead to lower detection of bacterial RNA/DNA when using certain diagnostic methods. In current methods, water samples are taken from the tap in sterile bottles with preservative after which these bottles are shipped and stored at 5°C to the laboratory and generally processed within 24 hours of sample collection. Sylphium's Dual Filter Capsule (DFC) method offers an alternative sampling method. The DFC method consists of a filter capsule for sampling, preservation after sampling, and an isolation kit. The filtration is performed during sampling and the RNA/DNA is directly preserved in the capsule. This filter capsule can also be stored and transported at room temperature. The DFC method has potential, but has not yet been applied for bacteriological RT-(q)PCR, qPCR or next generation sequencing (NGS) studies in drinking water-related matrices. In this project, a comparison study was carried out in the laboratory whether the DFC method is a more suitable method for RNA/DNA research in drinking water samples than the current detection methods (bottle sampling, filtration in the laboratory, and DNA isolation with kit). The DFC method was tested for detection of Legionella pneumophila, comparing the results with the current detection method. The tests were performed with tap water samples mixed with surface water and/or cultured cells at different concentrations. The DFC method is effective in isolating DNA. At high concentrations of L. pneumophila, the DFC method also shows higher concentrations of the specific genes than the current method. For low concentrations, the results of both methods are similar. For preservation of RNA, the DFC method was tested for detection of E. coli and Enterococci. Again, several tests were performed with tap water samples mixed with surface water, iron and manganese-containing groundwater, and/or cultured cells at different concentrations. The isolation of RNA using the DFC method is not yet optimal. The Cq values of E. coli, Enterococci and internal control are higher (implying lower numbers of gene copies) and fluctuate less per water sample than observed with the current detection method. RNA isolation works better for gram-negative bacteria than for gram-positive bacteria. It is expected that optimisation lies mainly in using the protein lysozyme (in addition to chemical lysis) for better degradation of cell walls. It is notable that for RNA isolation, less inhibition seems to occur with the DFC method in surface water and groundwater sample compared to the current method, in all likelihood this is due to the isolation kit of the DFC method. The DFC method has potential to be used for better preservation of samples, based on this study, currently only for DNA analysis. In subsequent research, it is recommended to further validate the potentially reduced inhibition during PCR with complex water matrices and organisms (for DNA analysis), and to include time dependence of filter capsule preservation. It could also be investigated whether reprocessing the entire sample in the DFC method results in lower detection limits (currently only 40-57% of the sample material is used). This could possibly also be achieved by using a different DNA isolation kit than the one provided with the DFC method. Furthermore, it could be investigated whether the use of the protein lysozyme (in addition to chemical lysis) in the RNA/DNA isolation kit from Sylphium can better destroy cell walls and thus generate higher RNA concentrations generated. Finally, it can be investigated whether the filter capsule can be used in the preculture for Vitens.